My Ssec Capstone Project INTRODUCCION Los exosomas son pequeñas vesículas

INTRODUCCION Los exosomas son pequeñas vesículas

INTRODUCCION

Los exosomas son pequeñas vesículas, miden alrededor de 100 nm de diametro, se forman dentro de los MVBs (cuerpos multivesiculares intracelulares) y son liberados por via endocitica hasta que se fusiona con la membrana plasmática y son expulsados al espacio extracelular como vesículas intraluminales (ILVs). Al principio se creía que los exosomas eran unas vesículas que contenían todos los residuos de desecho, ahora sabemos que los exosomas están relacionados con la comunicación intercelular a grandes distancias para transferir mRNA, proteínas, miRNA. Las membranas de los exosomas están formadas de colesterol, esfingomielina y ceramida y proteínas asociadas a estos lípidos, esta composición le permite a los exosomas ser realmente estables y por lo tanto ser recolectados por fluidos tales como sangre u orina.

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El mecanismo de formación no esta del todo claro, se sabe que se forman como ILVs, es decir por una inavaginacion de la membrana. Ahora bien como el articulo : hay dos mecanismos uno que depende de ESCRT (endosomal sorting complexesrequired for transport) y el otro que no.

El mecanismo dependiente de ESCRT consiste en un complejo de proteínas citosolicas que son reclutadas por los endosomas gracias las proteínas de memebrana (ubiquitina). Esta ubiquitina es reconocida por ESCRT -0 y se recluta por la membrana endosomal, de ahí pasa al ESCRT -1 que reconoce la ubiquitina gracias a que tiene Tsg101. Este mecanismo tiene una doble funsion por un lado poner en contacto las prtoeinas con el endosoma y por otro inducir la curvatura de la membrana endosomal para formar los ILVs.

? Por otro lado, el mecanismo independiente de ESCRT esta menos claro, este mecanismo depende de la tetraspaniana CD63, cuya función tampoco esta clara pero intuimos que gracias a la forma de cono de los lípidos como la ceramida se permite la curvatura de la membrana.

Una vez formados los ILVs pueden tener 3 destinos diferentes: pueden unirse a lisosomas, contribuir a la biogénesis de estos o fusionarse con la membrana plasmática y ser expulsados al exterior convirtiéndose en exosomas.

Una vez los ILVs han sido expulsados se dirigen a una celula aceptora, cuando la han localizado ese exosoma tiene que fusionarse con la celula aceptora. Para realizar esta fusión hay dos modos: de manera directa con la membrana plasmática de la celula aceptora, o por medio de una “back – fusión” que consiste en la fusión de la membrana del exosoma, previamente envuelto por la celula aceptora, y la mebrana de algún orgánulo de esa celula. Este ultimo proceso no esta del todo claro pero se piensa que requiere de un lipido llamado LBPA y una proteína Alix.

Parece que la entrada de las moléculas al interior de los exosomas es especifica ya que no cualquier molecula es capaz de ingresar al exosoma. Se ha visto que esa entrada esta relacionada con la presencia de ubiquitina o la asociación de SUMO a otras proteínas, favoreciendo su carga en el interior.

Se ha visto que no todos los tipos celulares son capaces de secretar endosomas debido a que no poseen un sistema de endomembrana, aunque la gran mayoría de la células de los ammiferos si que poseen este sistema. Asi las células del sistema inmune como los linfocitos B, las células dendríticas o los mastocitos son las células que están constantemente secretando exosomas.

Los exosomas realizan muchas funciones diferentes, una de las mas destacadas es la respuesta inmune, como la diseminación o protección contra enfermedades como el cáncer o la infectividad por ciertos parasitos. Otra de las funciones que se les atribuye esta relacionada con la diferenciacion de las células madre y los procesos regenerativos. Ademas contribuyen en el transporte de mRNA y microRNA, y se ha visto que estos acidos nucleicos tienen efectos funcionales en esas células aceptoras. Por ejemplo se ha visto que si se transfieren exosomas de raton a células humanas, y esos mRNA se convierten en proteínas de raton. Del mismo modo ocurre con los microRNA, son fragmentos de doble cadena de RNA que son capaces de regular el mRNA y por tanto tienen función en las células aceptoras.

Los exosomas son de gran importancia en la actualidad porque como ya hemos comentado están involucrados en la comunicación intercelular y su consecuente transmisión de macromoléculas, debido al contenido que tienen los exosomas (proteinas, lípidos, mRNA, microRNA, DNA). También se ha visto que están pueden actuar como vectores de drogas ya que están compuestos de membranas celulares por lo que son mejor tolerados por la celula aceptora. Esto hace que sean de especial interés en la investigación contra el cáncer.

Por eso nos vamos a centrar en explicar las técnicas utilizadas en el articulo… para demostrar la transferencia de exosomas de celula a celula. En este articulo hacen investigaciones relacionadas con los exosomas y el cáncer.

En este articulo su objetivo es observar la factibilidad de los exosomas como vectores de drogas, en este caso agentes quimioterapéuticos como es el paclitaxel (PTX). Para ello desarrollaron y compararon diferentes métodos de cargar los exosomas expulsados por los macrófagos con el fármaco PTX para ver su tamaño, estabilidad, y la eficacia antitumoral in vitro. Para ello siguieron un protocolo como el de la imagen a continuación:

Para demostrar esa transferencia por medio de exosomas los autores del artículo realizaron diferentes experimentos. Lo primero que hicieron fue incorporar el fármaco PTX a los exosomas de 3 maneras diferentes: incubación a temperatura ambiente, electroporacion y sonicacion. Para ello analizaron la capacidad de carga que tenían los exosomas utilizando la técnica HPLC, los resultados de las diferentes capacidades de carga se muestran en la tabla. Se vio que la cantidad de PTX introducida en los exosomas era menor en la incubacion a temperatura ambiente, un poco mayor en la electroporacion y máxima en la sonicacion. También determinaron el tamaño de las nanoparticulas por medio de la técnica DLS (dynamic light scattering) y vieron que también tenían el mismo orden creciente en tamaño que cuando midieron la cantidad de PTX introducida en los exosomas. Hicieron un nanoparticle tracking analysis (NTA), para analizar y visualizar partículas en liquidos que relaciona la velocidad del movimiento browniano con el tamaño de la particula, que confirmo los datos obtenidos. Los exosomas sonicados en ausencia de PTX eran mas grandes que los sonicados con PTX.

Se supuso que estaba relacionado con la estabilización de la membrana exosomal gracias a la intorduccion del fármaco PTX, mas tarde gracias a los estudios de fluorescencia también vieron que la viscosidad de la membrana disminuía con la sonicacion. Por eso analizaron los niveles de Alix, TSG101, Y Flotilina en los exosomas antes y después de la sonicacion utilizando la técnica de western blot, llegando a la conclusión de que la sonicacion no estaba directamente relacionada con esa perdida de la viscosidad de la membrana porque no se alteraban de manera exagerada los potenciales zeta de las partículas. Después se vio que la membrana recuperaba su viscosidad tras una incubación a 37 ºC durante una hora justo después del proceso de sonicacion, recuperando también esa forma redondeada típica de los exosomas.

Se analizo el tiempo que tardaban los exosomas en secretar su contenido y se vio que durante las tres primeras horas secreteban la mayoría de su contenido y luego mantenían la secreción de sustnacias en el tiempo pero menor cantidad. Se dieron cuenta de que con la técnica de sonicacion los exosomas podían almacenar una mayor cantidad de farmaco y por ello se decidió que los exosomas obtenidos por sonicacion serian los utilizados en el experimento.

Una vez que ya habían elegido con que exosomas iban a trabajar pasarin a analizar la eficacia terapéutica de estos en células cancerígenas in vitro. es decir que estudiaron la habilidad que tenian esos exosomas de transportar ese farmco a las células diana. Para ello utilizaron exosomas provenientes de la línea celular 3LL-M27 marcados con un fluorocromo y comparados con liposomas, nanoparticulas de poliestireno y nanocarriers. Una vez obtenidas las muestras las observaron a microscopio confocal y se dieron cuenta de que había una gran acumulación de exosomas en las células cancerígenas comparado con los liposomas y las nanoparticulas. Los exosomas eran 30 veces mejor endocitados que cualquier nanoparticula lo que sugería que el PTX llevado por los exosomas podía ser transportado de manera eficiente hasta las células cancerígenas. Esto suponía que se podía crear una terapia contra el cáncer basada en el transporte de fármacos por los exosomas confirmando la hipoteisis principal.

Tras demostrar esa hipótesis debían comprobar los efectos citotxicos de los exosomas PTX, ya que estos podían alterar el trafico intracelular y traspasar las membranas mejor que el taxol por ejemplo. Para ello midieron los niveles de un fluorocromo en un sustrato Pgp (transportador de fármacos que limita considerablemente la eficacia de los quimiterapeuticos), Dox, que fue incorporado a los exosomas exoPTX en las células MDCKMDR1 y en las MDCKWT. Los resultados del western blot dictaminaron que los niveles de expresión de Pgp eran mayores en las células MDCKMDR1 mientras

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